Trabajo realizado en el marco del Programa Acortando distancias.
Febrero de 2012.
ANII. - FACULTAD DE CIENCIAS. Sección Limnología.
TUTORA: Dra. Sylvia Bonilla.
PASANTES: Prof. Hanry Llanes – Profa. Daisy Imbert.
PROTOCOLO
Análisis de la calidad del agua a través de bioensayos.
- OBJETIVO:
- Valorar la calidad del agua utilizando Daphnia pulex .
B. MATERIALES Y EQUIPOS:
Materiales biológicos:
[1]
- 10 D. pulex adultos que no tengan crías eclosionadas
- 50 D. pulex neonatos.
- 120 ml de agua contaminada de (cianobacterias muestra natural o de efluente o de agua con un contaminante en particular.)
Materiales de laboratorio:
- Pipetas.
- Lupa de mano.
- Lupa binocular.
- Placas multipozas o hueveras de plástico transparentes.
- Papel blanco.
- Marcador.
- Vaso de bohemia.
- Bandejas.
- Calderín (malla de 390 µm) para adultos y juveniles.
- Copo o cernidor con malla de 100 µm para neonatos.
- Agua mineral Nativa.
- Alimento en base a algas y/ o levadura seca diluida.
Equipos:
- Termómetro.
- Timer (16 horas de luz y 8 de oscuridad)
- Luz artificial (2 tubos de luz de 18w)
- pH metro o papel de tornasol.
C. METODOLOGÍA:
I. Procedimiento previo:
- Preparación y lavado.
- Recipientes para dafnias: utilizar solamente recipientes que hayan contenido agua, cuyo volumen oscile entre 2 y 3 litros, preferentemente de vidrio. Deben permanecer cerrados para evitar la contaminación con otros organismos acuáticos. Realizar el lavado de los mismos con agua destilada o con agua mineral (se recomienda marca Nativa por su composición iónica).
- Recipientes de cianobacterias: utilizar solamente recipientes que hayan contenido agua, verificando que no hayan tenido otras sustancias (jugos, combustibles u otros).
- Las mallas empleadas para el filtrado, al igual que los demás materiales que se usen, deben ser lavadas antes de su utilización con agua destilada. Si se necesita utilizar detergente, debe ser neutro, usando agua potable, luego enjuagarlas varias veces con agua destilada.
- El resto de los materiales a utilizar, (ej: pipetas, vaso de Bohemia, otros) deben estar lavados previamente con agua potable y luego agua destilada.
- Obtención de dafnias. [3]
- Luego de obtener una muestra de agua con dafnias, mediante el uso de una red de plancton, o calderín o botella, se deben seleccionar los adultos, utilizando una pipeta y colocarlos en un recipiente con agua mineral Nativa para obtener un cultivo monoespecífico. De esta forma se evitará que en el agua se encuentren otras especies que comparten el hábitat con las dafnias, tales como los copépodos.
- Para el inicio del cultivo son suficientes 20 organismos.
- Debe usarse pipetas de plástico de 3 ml o similar.
- Mantenimiento de dafnias.
- Para el mantenimiento se colocan en frasco de boca ancha, en agua Nativa, se alimentan con algas clorofitas y/o levadura diluida (se coloca 1ml de solución de levadura/litro de cultivo de D. pulex y 5ml de cultivo de algas/litro de cultivo de D. pulex, cada 48 horas).
- Los recipientes se colocan a 8 y 25 cm de los tubos de luz a una temperatura de 20ºC ± 2ºC.
- El pH debe ubicarse dentro del rango de 6 a 9.
- El fotoperíodo debe ser de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
- Los cultivos deben ser filtrados semanalmente. Utilizando los filtros se separan los adultos y juveniles de los neonatos. El filtro o calderín para adultos o juveniles corresponde a una malla de 390 µm, mientras que para separar los neonatos se utiliza una malla de 100 µm. Se aprovecha el filtro para ir quitando las mudas.
- Para obtener individuos idénticos genéticamente, se coloca una D. pulex adulta en un recipiente. De esta forma por partenogénesis se consiguen individuos monoclonales.
- Obtención de Cianobacterias.
Las muestras naturales se toman de sitios con alta abundancia de cianobacterias, observación macroscópica en campo (agua con fuerte coloración, ver Manual de Cianobacterias, capítulo 8). Se filtran las mismas con redes de zooplancton.
II. Procedimiento de preparación de los bioensayos.
- Selección de dafnias.
- Adultos. Se eligen entre 15 a 25 D. pulex adultas de los cultivos existentes en el laboratorio, se trata de seleccionar del mismo tamaño, se utiliza solo observación macroscópica con o sin lupa de mano. Bajo lupa binocular se seleccionan 10 D. pulex del mismo tamaño, que no presenten crías eclosionadas.
- Neonatos. Los neonatos son más sensibles a la toxicidad de las cianobacterias u otras sustancias, por lo tanto si se logran cultivar es preferible usar neonatos en el lugar de adultos, se deben seleccionar 5 para cada poza, por lo tanto se necesitarán 50 neonatos (5 pozas de control y 5 del tratamiento) Para la obtención de neonatos se deben filtrar el día anterior a la realización del ensayo para que los individuos tengan entre 0 y 24 horas. Luego bajo lupa binocular se seleccionan 50 neonatos de D. pulex del mismo tamaño, descartando los juveniles.
- Se coloca una gota de agua nativa en cada poza y allí se dispone un individuo de D. pulex o 5 neonatos.
- Identificación de cianobacterias.
- Observación microscópica de las muestras naturales obtenidas, para determinar la existencia de las mismas.
- Posteriormente se obtienen 120 ml (100 ml para repartir en 10 pozas de 10 ml cada una y 20 ml extras). 5 pozas corresponden al tratamiento y 5 pozas al control.
- Se extrae una muestra de 2 ml a 5 ml y se fija con formol al 1%.
- Preparación del tratamiento:
- En 5 pozas que contienen D. pulex agregamos 10 ml de la muestra de agua, ya sea con cianobacterias o agua de efluente. A las otras D. pulex que servirán de control les colocamos agua nativa.
- Se puede agregar un control con alimento y otro con alimento y cianobacterias o alimento y agua de efluente.
- Al terminar se verifica el número de neonatos en cada poza y el estado de los mismos o el estado de los adultos.
- Al colocar el tratamiento se registra la hora y la temperatura.
- Se registra el pH del agua que se analizará o el agua que contiene las cianobacterias antes de colocarla en las pozas.
Nº de réplicas | Cladóceros en cada poza. | Medio | |
Control sin alimento | 5 | 1 adulto o 5 neonatos | |
Control con alimento | 5 | 1 adulto o 5 neonatos | Agua Nativa + Alimento (3/1) |
Control con alimento y cianobacterias. | 5 | 1 adulto o 5 neonatos | Alimento + cianobacterias o agua efluente. |
Tratamiento | 5 | 1 adulto o 5 neonatos | Cianobacterias o agua efluente. |
III. Procedimiento al finalizar el bioensayo.
- Obtención de datos.
- Se observan las D. pulex con lupa de mano para constatar su estado.
- Contabilizar bajo lupa binocular en cada poza las dafnias que se encuentren en estas condiciones: NADANDO NORMALMENTE, PARALIZADAS O MUERTAS
- Se observan luego con lupa binocular para registrar si presentan o no contenido intestinal.
- Posteriormente se retiran las dafnias de las pozas para proceder a la medición del pH.
- Se inicia la medición en las pozas que contienen las dafnias de control, luego se mide las pozas que contenían el cultivo de cianobacterias de control y posteriormente las del tratamiento.
- Lavado del material.
· Luego de los bioensayos, antes de tirar los tratamientos, a los recipientes que contuvieron cianobacterias o efluentes se agrega hipoclorito para matar las cianobacterias y dafnias, se enjuaga cinco veces con agua potable y posteriormente con agua destilada.
D. ANÁLISIS DE DATOS:
Calcular el promedio y desvío estándar del número de D. pulex que se encontraron en las categorías: muerto, paralizado y nadando. También se calcula el porcentaje de cada categoría para poder evaluar los grados de toxicidad de la muestra. Para probar que el agua es tóxica tienen que existir diferencias significativas entre el control y el tratamiento, para ello se utiliza el análisis de varianza. Si existen diferencias se concluye que hay toxicidad positiva y se deberán usar otros métodos (ELISA) para realizar la cuantificación de la toxina.
E. BIBLIOGRAFÍA:
- Bonilla, S. 2009. Cianobacterias Planctónicas del Uruguay. Manual para la identificación y medidas de gestión. UNESCO. Montevideo.
http://www.unesco.org.uy/phi/biblioteca/handle/123456789/473>
- Castillo, G. 2004. Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. Estandarización, íntercalibración, resultados y aplicación”. http://web.idrc.ca/en/ev-66572-201-1-DO_TOPIC.html
- González, S., Espínola, J., Bonilla, S. 2011. Protocolo para detección de neurotoxinas de cianobacterias mediante bioensayos agudos con D. pulex. Facultad de Ciencias. Montevideo. http://www.dinama.gub.uy/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=88&Itemid=367<.
[1] Nombre común: dafnias o pulgas de agua. Obtenida de: http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSn1b_XAZm38Sg9nZIlMorje1Wf3gvpJt9mMcC6pvScMjxG2mSz
[3] En caso de no conseguir muestras naturales; contactarse con el Dr. Julio Espínola, <julio.espinola@imm.gub.uy>
[4] Calderín para filtrar adultos y filtro para neonatos (color rojo). Fotos tomadas en laboratorio de IMM.
[5] Agua con cianobacterias. Puente Centenario sobre el Río Negro. Paso de los Toros. Foto tomada el 20 de febrero de 2012
[7] Muestra de cianobacteria obtenida en el Río Negro, costas de Paso de los Toros el 21 de Febrero del 2012 y observada con microscopio con aumento 400x.
